Testarea moleculară și detecția de anticorpi în coronaviroză: de ce sunt atât de importante? – explicația științifică și studiu de caz în Europa

“O persoană inteligentă rezolvă o problemă. O persoană înțeleaptă o evită.” – Albert Einstein

Știința se bazează pe cercetare, pe analiză, pe testare; înseamnă să gândim consistent și consecvent. Știința este în fapt un mod sistematic de gândire, care corelează, construiește și organizează cunoștințele și observațiile empirice sub formă de explicații, predicții și modele testabile despre Natură și Univers.

Biochimia a cunoscut progrese importante datorită descoperirilor ce ţin de mecanismul de funcţionare al acizilor nucleici, adică al ADN-ului (acidul dezoxiribonucleic) şi al ARN-ului (acidul ribonucleic), urmate apoi de investigaţiile desfăşurate în domeniul geneticii moleculare. Strategia utilizată într-un proiect de identificare, izolare şi clonare a secvenţelor nucleotidice poate fi utilizată cu succes în obţinerea unor proceduri de testare eficiente pentru detectarea virusurilor. Nu putem să cunoaștem, să înțelegem și să acționăm dacă nu testăm, dacă nu experimentăm: proiecția dinamicii de transmitere a virusului SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) doar așa se poate face [1]. Importanţa testării a mai fost deja discutată inclusiv aici, în urma cu câteva săptămâni [2]. Însuși directorul general general al Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii (OMS – https://www.who.int/), spunea: “You cannot fight a fire blindfolded. And we cannot stop this pandemic if we don’t know who is infected” (“Nu poți lupta într-un incendiu cu ochii legați. Și nu putem opri această pandemie dacă nu știm cine este infectat”).

Conform recomandărilor Uniunii Europene, testele de laborator precise si efectuate în timp util reprezintă o parte esențială a managementului pentru încetinirea pandemiei. Testele de laborator sunt importante în susținerea deciziilor privind strategiile de control ale infecției și gestionarea pacienților la unitățile de asistență medicală, precum și în detectarea cazurilor asimptomatice, prin care virusul se răspândeşte dacă persoanele în cauză nu sunt izolate. Testarea pentru a identifica și a diagnostica corect boala cauzată de acest virus – CoViD-19 (coronavirus disease 2019), se poate face în două moduri distincte [3]. Să le luăm pe rând și să le înțelegem.

Primul mod de testare, direct, poate identifica virusul SARS-CoV-2 și include metode care detectează prezența virusului propriu-zis în stadiul incipient al bolii prin analiza moleculară. Tehnica folosită se numește RT-PCR, acronim de la “Reverse transcription-polymerase chain reaction” (Reacția de polimerizare în lanț cu revers-transcriptază) [4] și care detectează urme de virus în probe de mucus sau salivă. Testarea  este influenţată însă de cantitatea de virioni (particule virale) eliminată din organism prin mucus sau salivă, de modul de prelevare a probei (dacă s-a făcut în mod corespunzător de către cineva cu experienţă în a recolta aceste tampoane), de condiţiile de transport şi de cât timp a stat proba în transport.

Procedura trebuie detaliată puţin pentru a înțelege modul de funcționare și complexitatea ei. Această tehnică are la bază o tehnologie în vitro care imită capacitatea naturală de replicare a acizlor nucleici și care constă în generarea rapidă a unor copii multiple ale unei secvențe nucleotidice tintă (ADN sau ARN) dintr-o genă de interes sau un patogen specific – în cazul nostru, ARN-ul virusului SARS-CoV-2.

Produsul multiplicat prin PCR este apoi detectat prin diverse metode. Numărul de copii ale secvenței tintă crește exponențial cu fiecare ciclu de amplificare, deoarece fiecare secvență nucleotidica nou sintetizată constituie o matriță pentru o nouă copie. Produsul PCR care reprezintă o copie a ARN-ului țintă original este denumit amplicon. Această metodă permite detectarea cu specificitate foarte mare a unor concentrații extreme de mici ale secvenței țintă. Amplificarea se realizează într-un analizor special numit “thermal cycler” iar amestecul de reacție trebuie să conțină următoarele elemente:

• ARN-ul țintă, extras din probă în cursul etapei de prelucrare: tipurile de eșantion validate includ tampon nazal, faringian, oral sau nazofaringian, și care presupune apoi plasarea eșantionului tampon într-un mediu de transport viral. Urmează pipetarea unei proporții din eșantion într-un cartuș de unică folosință. Această etapă de pregătire este de obicei citată să dureze aproximativ 2 minute, dar poate dura chiar și 5-10 minute pentru unele dispozitive.
• Enzima care facilitează sinteza lanțului complementar de acid nucleic, și anume rTth ADN polimeraza pentru o țintă ARN cum este cazul virusului SARS-CoV-2. Ca o paranteză, rTth ADN polimeraza este o polimerază termostabilă recombinantă, derivată din Thermus thermophilus (o bacterie Gram negativă utilizată într-o serie de aplicații biotehnologice, inclusiv ca organism model pentru manipularea genetică, genomica structurală și biologia sistemelor), cu activitate optimă la 70-80 °C. Această enzimă are activitate atât de revers-transcriptază, cât și de ADN polimerază (permite realizarea în același amestec de reacție atât a transcrierii inverse a ARN-ului țintă în ADN complementar (ADNc), cât și amplificarea ADNc).
• Cofactori enzimatici, de obicei ioni de mangan (Mn2+), fiindcă aceștia eficientizează activitatea revers-transcriptazei.
• Primeri (P1 și P2), adică secvențe scurte, monocatenare, cu lungimea maximă de 20-30 nucleotide, care se leagă de o matriță monocatenară prin împerecherea complementară a bazelor. Acesta servesc ca punct de plecare pentru sinteza lanțului complementar cu ajutorul ADN polimerazei, marcând începutul și sfârșitul regiunii care trebuie să fie amplificată.
• Deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP și dUTP, adică deoxiadenozină trifosfat, deoxiguanozină trifosfat, deoxicitidină trifosfat și deoxiuridină trifosfat), folosite pentru sinteza noii catene ADN prin atașarea lor la capătul primerilor, complementar cu matrița.
• Amperaza, enzima care promovează amplificarea selectivă a țintei și distrugerea produșilor de contaminare din cursul reacțiilor de amplifcare anterioare. Aceasta catalizează clivarea ADN-ului care conține deoxiuridină la începutul primului ciclu de amplificare și nu degradează ARN-ul țintă.

Din această cauză, procedura PCR este cronofagă (durează aproximativ 4 ore sau chiar 5 ore), dar rezoluția ei este net superioară, de ~80% și chiar peste. Rezultatul final presupune două variate posibile, respectiv “pozitiv” sau “nedetectabil” (negativ). În limitele erorilor experimentale, “nedetectabil” poate să fie un rezultat fals, de aceea protocoalele recomandă repetarea testelor la diferite intervale de timp.

Al doilea mod, indirect, se bazează pe detecția de anticorpi produși ca răspuns la infecția CoViD-19. Detectarea anticorpilor (serologie) se poate face în două moduri diferite: prin teste rapide și prin teste de înaltă rezolutie.

Testele de diagnosticare rapidă se bazează pe detecția unor imunoglobuline (IgG si IgM) specifice coronavirusurilor – dar nu neaparat SARS-CoV-2, și au nevoie de 10-30 de minute pentru a da rezultate. In plus, se poate observa din figura alăturată că relevanța lor este nulă în primele zile de la infectare. Din această cauză au o rezoluție foarte scăzută în ceea ce privește specificitatea și sensibilitatea, de aproximativ 30-60%, însă avantajul lor este costul scăzut și ușurința în manipulare.

De cealaltă parte, majoritatea testelor de serologie de înaltă rezolutie sunt încă în stadiul de cercetare: testele ELISA, acronim de la “Enzyme linked immunosorbent assay” (Analiza imunosorbantă legată de enzime), sunt o serie de proceduri care durează între o ora și 5 ore, cu sensibilitate și specificitate de ~95%, în special dacă este cuplată cu o metodă spectrofotometrica.

• ELISA este un format popular de analiză biochimică analitică tip “umed-laborator” care folosește o imunotestare a enzimei în fază solidă pentru a detecta prezența unei substanțe, de obicei a unui antigen, într-o probă lichidă sau într-o probă umedă, folosit ca instrument de diagnosticare în patologia medicală. Antigenii din probă sunt atașați la o suprafață. Apoi, se aplică un alt anticorp specific pe suprafață, astfel încât să se poată lega de antigen. Acest anticorp este legat de o enzimă și, în etapa finală, se adaugă o substanță care conține substratul enzimei. Reacția ulterioară produce un semnal detectabil, cel mai frecvent o modificare a culorii în substrat. Efectuarea unui test ELISA implică cel puțin un anticorp cu specificitate pentru un anumit antigen. Proba cu o cantitate necunoscută de antigen este imobilizată pe un suport solid fie nespecific sau specific. După ce antigenul este imobilizat, se adaugă anticorpul de detecție, formând un complex cu antigenul.
• Există mai multe tipuri de testare ELISA, dar 4 sunt cel mai des întâlnite: ELISA direct, ELISA tip sandwich, ELISA inhibitor / competitiv (competiție între liganzi pentru un anumit tip de receptor molecular), ELISA indirect.

Detectarea anticorpilor poate fi utilizată atât pentru diagnostic, cât și pentru supravegherea populației. Prezența anticorpilor din sânge indică deci câte persoane au sau au avut deja boala, inclusiv cele ale căror simptome erau minore sau care erau asimptomatice. Se teoretizează că acești oameni au un anumit nivel de imunitate dobândită, deși momentan nu există nicio garanție de imunitate deplină sau cât va dura orice apărare dezvoltată în organism față de virusul SARS-CoV-2.

De ce sunt atât de importante aceste testări, care sunt complementare din punctul de vedere al modului de analiză și identificare în CoViD-19? Pentru că permit diagnosticarea corectă, cu sau fără alte moduri de analiză prin imagistică (ecografie, radiografie, computer tomografie etc, pe care le vom discuta într-un articol viitor). Testarea este urmată apoi de posibilitatea administrării tratamentului și/sau a prelevării de plasmă convalescentă – serul sangvin obținut prin prelevarea de sânge de la donatori, ce conține anticorpi și care este apoi folosit în încercarea de a imuniza alți bolnavi. Dar în Romania nu există încă protocoale clare pentru tratament cu plasmă convalescentă [6].

Până în 23 aprilie 2020, țările care și-au publicat datele de testare au efectuat, în medie, un număr de teste egale cu doar 1,2% din populația lor și nicio țară nu a testat un număr de probe care să depășească 12-13% din populație. Această variabilitate poate afecta, de asemenea, ratele de fatalitate raportate ale cazurilor, care au fost probabil supraestimate în multe țări, din cauza erorilor de eșantionare. Tocmai din această cauză este important să menținem distanțarea socială, să ne spălam des pe mâini, iar când ieșim în spațiul public să folosim masca și ochelari [7]. Astfel de măsuri au fost corect adoptate de către populație încă de la începutul epidemiei în țări precum Coreea de Sud, Taiwan, Singapore și Hong Kong. Până acum, Statele Unite ale Americii au efectuat 4.470.750 de teste.

Să luăm acum în discuție ceea ce se întâmplă în Europa. În top se află Islanda, care a reușit să testeze masiv populația, mai eficient decât oriunde altundeva din lume. Pe de altă parte, populația Islandei este de doar 364.134 locuitori. Ca număr de teste efectuate, însă, pe primele locuri sunt Germania, Italia și Spania, Marea Britanie și Franța. În Germania, acest număr se ridică astăzi la un total de 2.072.669 teste efectuate, fiind pe primul loc în Uniunea Europeana [8]. În România, din datele publicate de către Ministerul Sănătății, această rată are o medie de ~6.000 de teste la un milion de locuitori cu 113.336 teste efectuate, fiind astfel poziționată alături de țările Scandinave. Pe ultimile locuri sunt Irlanda, Letonia, Croația (cu 24.186 teste), Bulgaria (cu 26.417 teste) și Malta (cu 25.645 teste efectuate).

Pe de altă parte, Germania efectuează prima testare de anticorpi COVID-19 pe scară largă din Europa pentru a monitoriza ratele de infecție și pentru a preveni răspândirea virusului [9]. Potrivit Institutului “Robert Koch”, agenția federală de control și prevenire a bolilor din Germania, prima parte a studiului vizează serviciile de donare de sânge din țară. O a doua etapă se va concentra pe eșantioane din regiuni cu focare mari de coronavirus. În fine, o a treia etapă va presupune un studiu reprezentativ pentru tot restul populației din țară. Autoritățile spun că vor examina aproximativ 5.000 de probe de sânge la fiecare 14 zile, în timp ce regiuni precum Bavaria intenționează să recolteze aproximativ 3.000 de probe din gospodăriile selectate în mod reprezentativ. Testarea pentru depistarea de anticorpi a fost lansată săptămâna trecută, iar rezultatele inițiale sunt așteptate în luna mai. Germania, care-și produce intern cea mai mare parte a kit-urilor de testare, reușește astfel să testeze pentru COVID-19 la o scară mult mai mare decât majoritatea țărilor: se estimează un număr de 120.000 de teste pe zi într-o națiune de 83 de milioane de locuitori. Nivelul ridicat de testare a ajutat Germania să încetinească răspândirea virusului și să mențină scăzut numărul deceselor, după cum reiese din statistici, În acelaşi timp, Germania prevede măsuri de distanţare socială mai relaxate, ceea ce duce la o încetinire a economiei mai puţin abruptă.

România, prin institutele specializate din București aflate sub egida Academiei Române – precum Institutul de Biochimie (https://www.biochim.ro) sau Institutul de Biologie și Patologie Celulară “Nicolae Simionescu” (http://www.icbp.ro), ori prin instituțiile din celelalte mari centre universitare, ar fi putut furniza specialiștii în biochimie și biologie moleculară atât de necesari. Ar fi putut participa împreună – cercetători, epidemiologi, clinicieni, statisticieni și alți oameni de știință la formarea unor comisii de specialitate care să lucreze împreună cu autoritățile la elaborarea unor proceduri aplicabile la nivel național, poate chiar exportate și implementate în întreaga Uniunea Europeană. Dar marea majoritate a specialiștilor fie au plecat din țară, fie s-au reprofilat ca specialiști în vânzări de echipamente. Specialiștii ce încă profesează în România în domeniul în care s-au pregătit, unii dintre ei membri în “Rețeaua de Solidaritate”, sunt la datorie și fac recomandări [10]. Ei reprezintă însă o voce firavă fiindcă statul Român nu este interesat sa promoveze oameni competenți în funcții-cheie, oameni care să nu fie afiliați anumitor grupuri de interese. Statul Român nu știe sau nu vrea să aprecieze, să folosească și să păstreze o resursă pe care România o are în abundență: inteligența umană. Avem în schimb politicieni care cer despăgubiri occidentului pentru exodul de creiere [11].

Odată ajuns și în România, virusul a surprins un stat membru al UE în derivă și total nepregătit, în condiții grave, pe care le-a exploatat nemilos; boli cronice ale statului român –  precum o clasă politică coruptă, o birocrație sclerozată, o economie fără viziune și strategie, dar și o societate divizată, indiferentă și lipsită de energie. La 30 de ani de la “schimbarea” din decembrie ’89, am învățat să conviețuim cu simptomele cronicizate. A fost nevoie de amploarea și intimitatea unei pandemii pentru a conștientiza, din nou, aceste aspecte grave – deși mulți dintre noi încă nu le realizează. Dar asta este o alta discuție și nu-și are locul aici – efectele migrației și importanța diasporei pentru asanarea societății românești vor fi discutate într-un articol viitor.

Concluzia este că fiecare stat din Uniunea Europeană gestionează această pandemie în măsura posibilităților și disponibilității resurselor de care dispun. Fiecare guvern al fiecărui stat membru a decis, la nivel național, utilitatea testării, masivă sau măcar a personalului cheie – personal medical, forțe de ordine, personal implicat în activități inerente unei funcționări ”normale” ale societății (transporturi, serviciile publice, etc). Să nu uitam că avem de-a face cu un virus nou, despre care chiar și acum, la aproximativ 3 luni de la primele cazuri de infectare pe teritoriul comunității europene, se știu foarte puține lucruri și că nu există un tratament medicamentos clar definit. Apoi, Uniunea Europeană încă nu are prerogativele necesare pentru a acționa direct și unitar în acest sens pentru că programele medicale reprezintă doar 5% din portofoliul comunitar (restul de ~95% intrând în competența individuală a guvernelor statelor membre); spre deosebire de politicile agrare, unde Uniunea Europeana are un cuvânt clar și precis: ~95% din reglementari și finanțare sunt realizate prin deciziile comunitare și doar 5% de către statele membre.

Vom urmări cu interes evoluția ulterioară a politicilor comunitare ale Uniunii Europene în materie de sănătate publică, fiindca deja au fost demarate anumite proiecte și deblocate resursele necesare. Această pandemie ne-a dat clar de înțeles tuturor că sunt urgent și stringent necesare politici și directive comune pentru toate statele membre în acest domeniu. Cel mai probabil, această tristă și grea încercare ne va apropia și mai mult ca state, identitate și cetățeni ai Uniunii Europene. Ce va urma după pandemie?! Poate, sperăm la un “pașaport” cu adevărat European? O uniune mai apropiată de dorințele cetățenilor și o birocrație a Uniunii Europene coborâtă din turnurile de fildeș din Bruxelles și Strasbourg în realitatea de zi cu zi pe care o trăim noi toți? Foarte posibil și extrem de dorit, dar vom discuta despre toate acestea în articole viitoare…

Referințe:

1. Stephen M. Kissler et al., in “Projecting the transmission dynamics of SARS-CoV-2 through the postpandemic period”; Science (2020), in press; https://doi.org/10.1126/science.abb5793
2. Cătălin Constantinescu, in “Importanţa testării și a izolării în epidemia COVID-19”; Rețeaua de Solidaritate (25.03.2020); https://reteauadesolidaritate.com/importanta-testarii-si-a-izolarii-in-epidemia-covid-19/
3. Kile Green et al., in “Molecular and antibody point-of-care tests to support the screening, diagnosis and monitoring of COVID-19”; The Centre for Evidence-Based Medicine (07.04.2020); https://www.cebm.net/covid-19/molecular-and-antibody-point-of-care-tests-to-support-the-screening-diagnosis-and-monitoring-of-covid-19; https://www.cebm.net/wp-content/uploads/2020/04/POCT-Covid19.pdf
4. Victor M. Corman et al., in “Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR”; EuroSurveillance 25 (2020) 2000045; https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045
5. Roberto de la Rica et al., in “Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye”; Nature Nanotechnology 7 (2012) 821–824; https://doi.org/10.1038/nnano.2012.186
6. Mesagerul, în “Pietreanul care donează 18 aparate de recoltat plasmă acuză: ”Este o indolență criminală.(…) Suntem într-un paradis al proștilor.”; interviu cu dl. Florin Hozoc în Mesagerul de Neamț (22.04.2020); https://mesagerulneamt.ro/2020/04/pietreanul-care-doneaza-18-aparate-de-recoltat-plasma-acuza-este-o-indolenta-criminala-suntem-intr-un-paradis-al-prostilor/
7. Cătălin Constantinescu, în “Toți cu mască și ochelari: o măsura lesne și eficientă în combaterea CoViD-19”; Rețeaua de Solidaritate (12.04.2020); https://reteauadesolidaritate.com/toti-cu-masca-si-ochelari-o-masura-lesne-si-eficienta-in-combaterea-covid-19/
8. Statista Ltd., in “Coronavirus (COVID-19) tests performed in Europe as of April 22, 2020, by country”; https://www.statista.com/statistics/1109066/coronavirus-testing-in-europe-by-country/
9. Rob Schmitz, in “Germany Is Conducting Nationwide COVID-19 Antibody Testing”; National Public Radio (21.04.2020); https://www.npr.org/sections/coronavirus-live-updates/2020/04/21/839594202/germany-is-conducting-nationwide-covid-19-antibody-testing
10. Dan Pârvulescu, în “Strategii și măsuri de limitare a pandemiei COVID 19”; Rețeaua de Solidaritate (01.04.2020); https://reteauadesolidaritate.com/strategii-si-masuri-de-limitare-a-pandemiei-covid-19/
11. Mihm von Andreas, în “Rumänien verlangt eine Ablöse für seine Ärzte” (România cere despăgubire pentru medicii săi); interviu cu dl. Gheorghe Borcean, președintele al Colegiului Medicilor din România (21.04.2020); https://www.faz.net/aktuell/wirtschaft/corona-krise-rumaenien-verlangt-eine-abloese-fuer-seine-aerzte-16733635.html

Pentru aprofundare rapidă:

1. Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR) în diagnosticul molecular-genetic: https://youtu.be/2_vhlDrdFqs
2. Testarea rapidă în CoViD-19: https://youtu.be/Bs1sPSyjA8I
3. Procedura ELISA în diagnosticul imunologic: https://youtu.be/nNjlBCnpGZ4
4. Recomandările Uniunii Europene în privința testării rapide: https://www.ecdc.europa.eu/sites/default/files/documents/Overview-rapid-test-situation-for-COVID-19-diagnosis-EU-EEA.pdf

Sursa grafic (figură): https://www.sursamedicala.ro