Testarea moleculară: cum se face și de ce apar rezultate false. Putem vorbi de un vaccin?

“Arta medicinii constă în amuzarea pacientului în timp ce boala se vindecă în mod natural.” – Voltaire

François Marie Arouet, zis Voltaire, a fost un scriitor și filosof care a trăit în Franța între anii 1694 și 1778. De atunci și până astăzi s-au schimbat multe. Medicina nu mai este o artă, nu mai implică doar observaţiile empirice; este știința și practica stabilirii diagnosticului, a prognosticului, a tratamentului și a prevenţiei bolilor.

Astăzi, analizele și testele de laborator sunt cheia succesului.

Depistarea bolnavilor de coronaviroză se poate face prin două tipuri de testări: detectarea directă a virusului prezent în secrețiile nazale și faringiene cu ajutorul metodelor de analiză moleculară, sau indirect prin depistarea anticorpilor din sange prin teste de serologie. Un test viral informeaza despre o infecție curentă, iar un test de anticorpi informează despre o infecție actuală sau anterioară (IgM e anticorp de fază acută). Ambele sunt informații extrem de utile în evaluarea măsurilor de izolare [1]. Sunt favorizate testele virale, fiindcă este posibil ca un test de anticorpi să nu poată să depisteze o infecție curentă, deoarece poate dura 1-3 săptămâni pentru ca organismul sa produc anticorpi după apariția simptomelor.

Testarea moleculară pentru depistarea virusului SARS-CoV-2 se face prin tehnica RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction), care multiplică anumite molecule selectionate – gene sau fragmente de gene, și pe care le marchează cu ajutorul unor molecule de colorant fluorescent. Așasadar, testarea RT-PCR se bazează pe procesul de detecție al genomului virusului SARS-CoV-2 [2]. Performanța testelor RT-PCR trebuie însă evaluată în funcție de criterii precise, în special sensibilitatea testului (capacitatea acestuia de a fi pozitiv la un pacient care suferă de boală) și specificitatea acestuia (probabilitatea ca testul să fie negativ la persoanele sănătoase).

Genotipul și fenotipul coronavirusului SARS-CoV-2 sunt deja bine cunoscute. Alegerea genelor pentru analiza RT-PCR se face pentru o identificare a virusului clar diferențiată de alte surse ce pot contamina proba / tamponul. Detaliez puțin, pentru curiozitate (a se vedea și figura alaturată).

Gena “N” codifică nucleoproteina ce are un rol foarte bine definit, împachetând ramura pozitivă din ARN-ul genomului viral într-o ribonucleocapsidă elicoidală, jucând așadar un rol fundamental în timpul asamblării virionului prin interacțiunile sale cu genomul viral, în special cu gena “M” ce codifică proteina din membrană. Un alt rol important îl are atât în îmbunătățirea eficienței transcripției ARN-ului viral subgenomic, cât și în replicarea virală.

Mai departe, gena “S” codifică proteinele din “spike” (coroana virusului) care au trei funcții. Proteina “S1” din proteina “spike” din atașează virionul de membrana celulară prin interacțiunea cu receptorul gazdă și permite astfel inițierea infecției (prin asemănare); legarea la receptorii umani ACE2 și CLEC4M / DC-SIGNR și internalizarea virusului în endozomii celulei gazdă induce modificări conformaționale în glicoproteina “S”.

Proteoliza prin CTSL cathepsină demască procesul de fuziune a peptidei în cazul proteinei “S2” și poate activa fuziunea membranelor în endozomi. Proteina “S2” mediază fuziunea virionului și a membranelor celulare, acționând ca o proteină de fuziune virală de clasă I. În conformitate cu modelul actual, proteina are cel puțin trei stări conformaționale: starea de naștere pre-fuziune, conformatia intermediară pre- “ac de păr” și conformatia “ac de păr” post-fuziune. În timpul fuziunii membranelor celulare virale și țintă, regiunile pliate bobinat / elicoidal (procesul heptad se repetă) își asumă o structură trimer “ac de păr”, poziționând peptida de fuziune în imediata apropiere a regiunii C-terminale a ectodomeniului. Formarea acestei structuri pare să conducă apozitia și fuziunea ulterioară a membranelor virale și celulare țintă. Mai departe, proteina “S2′”acționează ca o peptidă de fuziune virală, care este demascată în urma clivajului “S2” ce apare la endocitoza virusului.

Epidemia de SARS-CoV-2 a adus, de asemenea, o nouă atenție asupra proteinelor traduse din “ORF1a” și “ORF1b” din gena de intrare ARN, cunoscută și sub denumirea de genă replicază / transcriptază. Este probabil ca proteinele “ORF1ab” să joace roluri în patogeneza virusului distincte sau în plus față de funcțiile direct implicate în replicarea virală. Studii genetice inverse recente au confirmat că proteinele de “ORF1ab” pot fi implicate în semnalizarea și modificarea celulară a expresiei genice celulare, precum și virulența prin mecanisme ce încă rămân a fi determinate.

Mai multe detalii despre cum funcționează și care sunt informațiile utile, precum și implicațiile clinice și epidemiologice ale testelor RT-PCR pentru evaluarea măsurilor de izolare, sunt prezentate în articolul dnei. Dr. Mihaela Sava [1]. Problemele apar când concluziile sunt eronate printr-un rezultat fals negativ sau fals pozitiv. O serie de articole atrag atenția asupra acestor fapte. Experții din Coreea de Sud au declarat că pacienții infectați cu coronavirus, dar care s-au însanatosit, s-ar putea să prezinte la testare din nou un rezultat pozitiv din cauza urmelor de particule virale inactivate [3, 4].

Să nu uităm totuși că testarea moleculară arată în fapt prezenta unor molecule, dar nu probează viabilitatea lor. Testarea PCR nu discriminează particulele active de cele inactive. Prin urmare, problema constă chiar în precizia foarte mare a testelor RT-PCR, care pot detecta urme provenite de la acidul ribonucleic al virusului SARS-CoV-2, chiar și în cazul în care acesta este „mort” (virusurile nu sunt organisme vii) [5], invalidând astfel diagnosticul.

Ceea ce știm acum este că virusul SARS-CoV-2 nu invadează interiorul nucleului celular de la un pacient, așadar necombinându-se cu ADN-ul uman, ceea ce înseamnă că virusul nu creează infecții cronice. Virusul care declanșează COVID-19 este în concluzie diferit de cele care declanșează boli precum HIV sau hepatita B, în care virusul respectiv rămâne în stare latentă în interiorul unui nucleu celular provocând ulterior infecții cronice și chiar decesul.

Putem deja vorbi de un vaccin? Se poate vorbi deja de un vaccin? Opiniile sunt împărțite. În știință, faptele primează, iar opiniile sunt subiective și de cele mai multe ori irelevante. Ceea ce știm acum este că se încearcă obținerea de rezultate pe toate pistele posibile.

Astfel, un potențial vaccin contra coronavirusului dezvoltat la Universitatea din Oxford (Marea Britanie) este în testare pe oameni începând cu 23 aprilie, iar un milion de doze ar putea fi gata prin luna septembrie [6]. Pe de altă parte, conform Centrului de Control si Prevenire al Bolilor (CDC) din Statele Unite ale Americii, încă nu știm cu siguranță dacă a avea anticorpi împotriva virusului poate proteja pe cineva împotriva reinfectării sau cât poate dura această protecție [7]. Profesorul Didier Raoult, specialist infecțiolog la Aix-Marseille Université din Franța, afirma într-un interviu că testarea unui vaccin este inutilă în acest moment. În timp ce studiile din aceasta fază inițială (faza 1) sunt în curs de desfășurare, planurile pentru capacitatea de producție la scară largă pot fi puse în pericol de aceste teste, însemnând că vaccinurile vor fi produse în număr mare cu riscul de a fi inutile dacă studiile arată că ele nu funcționează.

În concluzie, dacă nu există posibilitatea altor intervenții, o măsură esențială pentru a reuși să scăpăm cu bine din aceasta pandemie o reprezintă distanțarea socială și gesturile barieră simple, precum spălatul pe mâini și purtarea de mască și ochelari [11], în cazul în care capacitățile de îngrijire critică sunt depășite. Poate fi necesară o distanțare socială prelungită sau intermitentă până în 2022 – după cum spun unele modele epidemiologice [12]; sau poate dura până la sfârșitul lunii mai după anumite păreri ale jurnalistilor din România [13]. Intervenții suplimentare, inclusiv capacitatea de îngrijire critică extinsă și un tratament eficient, ar amplifica succesul distanțării intermitente și ar grăbi dobândirea imunității populatiei. În finalul acestui prim val al pandemiei, studiile serologice longitudinale sunt necesare urgent pentru a determina amploarea și durata imunității la SARS-CoV-2. Chiar și în cazul unei eliminări aparente, supravegherea SARS-CoV-2 ar trebui menținută, deoarece o reapariție a epidemiei ar putea fi posibilă până în 2024.

Referinte: